Применение методологии неспецифических биосенсоров в иммунологии на примере интерпретации титров специфических IgG человека.

Иммуноферментный анализ - инструментальный диагностический метод, широко используемый в на­стоящее время для определения концентрации раз­личных веществ [1]. В медицине данный метод в основном применяется для качественного и количе­ственного определения специфических белков (анти­тел), образующихся при иммунном ответе на тот или иной антиген [2, 3].

Одни из наиболее важных классов антител - им­муноглобулины класса IgG,, составляющие около 75-80% от всех иммуноглобулинов сыворотки и 10-20% общего белка сыворотки, играют основопола­гающую роль в обеспечении длительного гуморально­го иммунитета (период полураспада составляет около 23-25 сут), например при инфекционных заболевани­ях. Считается, что основной функцией иммуноглобули­нов IgG, является образование комплекса «антиген-ан­титело». Они способствуют нейтрализации бактери­альных экзотоксинов, фагоцитозу, фиксации компле­мента, а также могут участвовать в аллергических реакциях. Антитела этого класса появляются через некоторое время после контакта с антигеном и счи­таются основными антителами вторичного иммунного ответа на большинство антигенов у человека и жи­вотных. Дефицит IgG, ослабляет сопротивляемость организма к инфекциям [3, 4]. В таблице приведены референтные значения нормы концентрации IgG, для разных возрастных категорий.

Таким образом, изменение концентрации внутреннего метаболита (иммуноглобулина IgG) в границах условной нормы с точки зрения современной медицины не является свидетельством возникновения патологического процесса. Однако имеются данные, показывающие связь быстрого изменения концентрации IgG в пределах нормы с резким изменением физиологического состояния человека [5].

Цель нашей работы - создание математической модели для более корректного определения границы норма-патология на основе предложенной ранее методологии неспецифических биосенсоров, позволя­щей рассматривать биологический объект как динамическую систему и как следствие разрабатывать границы нормы с учетом индивидуального состояния организма. В настоящее время имеются многочисленные данные о появлении специфических антител IgG на тот или иной продукт питания у человека или животного. В этом случае наличие иммунного отве­та чаще всего связано с наличием у человека пищевой аллергии или непереносимости [6]. В случае по­явления и возрастания концентрации специфического к конкретному продукту IgЕ благодаря корреляции с клинической картиной диагностируется немедленная пищевая аллергия (пищевая аллергия I типа). Для специфических IgG такой прямой корреляции до настоящего времени не обнаружено, поэтому считается, что повышенная концентрация специфических IgG го­ворит о развитии скрытой пищевой аллергии или замедленной аллергии (пищевая аллергия III типа) [7].

Проанализируем состояние данного вопроса с точ­ки зрения теории биосенсирования, когда в качестве неспецифического биосенсора рассматривается изменение какого-либо параметра организма в ответ на изменение стимула, воздействующего на организм.

В настоящее время методы диагностики пищевой аллергии основаны на корреляции между концентрацией С_n специфических иммуноглобулинов класса IgE (для явной) и IgG (для скрытой) в сыворотке крови и иммунной реакцией организма на пищевой антиген. Величина С_n (1 ≤ n ≤ N), измеряемая «in vitro» на основе ИФА (иммуноферментный анализ.) для n-го пищевого антигена Р_n из N тестируемых, отождествляется с амплитудой n-го «иммунного отклика» системы на проникновение в кровоток макромолекул исследуемого продукта (Р_n) [8, 9].

Традиционный подход к решению проблемы опре­деления критерия норма-патология основан на моде­ли обработки данных, используемой в ИФА для диаг­ностики аллергических реакций немедленного типа (T-I) на основе определения изменения концентрации специфических IgЕ. В рамках данной модели шкала титров, определяемая выбранными значениями ка­либраторов, делится на четыре равных диапазона по степени возрастания титров, а амплитуды титров IgG, по аналогу с результатами титров IgЕ, полученных ИФА, располагают в пределах соответствующих диапазонов. Величина амплитуды единичных «иммунных откликов» общепринято считается главным критерием определения границы раздела между продуктами питания, вызывающими и не вызывающими аллергичес­кую реакцию (иммунный ответ) [10].

В отличие от иммуноглобулинов класса IgЕ, сосре­доточенных в тканевых структурах и имеющих постоянный и известный диапазон концентраций, имму­ноглобулины IgG локализуются в крови и имеют постоянно меняющийся «фоновый» уровень концентра­ций, существенно различный как для разных организмов, так и для разных состояний одного организма [11]. Вследствие этого селекция откликов по амплитудам на основе произвольно введенных цифровых или зональных критериев явно недостаточна для корректной диагностики скрытой пищевой аллергии по «иммунному ответу» даже в рамках одного теста и принципиально не позволяет сравнивать эксперимен­тальные данные различных тестов, но предложена для использования в диагностике [12].

С физической точки зрения иммунологический тест на IgG представляет собой совокупность ре­зультатов N независимых ИФА, каждый из которых отражает результат взаимодействия n-го пищевого антигена со специфическими антителами IgG, содер­жащимися в исследуемом образце сыворотки крови, при неизменных для данного теста параметрах экс­перимента.

Следовательно, результаты тестирования можно представить в виде значений дискретной функции Cn = f (Р1, P2 ... Рn ... PN), где Сn - измеряемая величина концентрации, Р_n - пищевые антигены, из­меняющие свою физическую природу при изменении индекса n. В данной постановке эксперимента набор экспериментальных данных (С₁, С₂ ... С_n} не может быть интерпретирован как совокупность незави­симых стохастических изменений характерного физического параметра, отражающего состояние объекта, в данном случае исследуемого образца крови. Это принципиальное положение, отражающее суть физической модели эксперимента, как правило, не учитывается при статистической обработке данных ИФА по концентрациям IgG. С математической точки зрения каждый суммарный результат i-го теста является выборкой {С₁, С₂ ... С_ы}₁ объемом N из генеральной совокупности Ng представленной в виде дискретного ряда, варианты которого С_n1 (1 ≤ п ≤ N) - величины концентраций IgG)_ni., экспериментально получаемые в i-м тесте для каждого n-го пищевого антигена. Ранжирование выборки N или упорядочение вариантов {С₁, С₂ ... Сn} по величине приводит к представлению полученных данных ИФА в виде «иммунного ответа» исследуемого образца крови на N пищевых антигенов. Графическое изображение типичного «иммунного ответа» в виде дискретного вариационного ранжированного ряда с вариантами С_n, определяющими «иммунные отклики» образца крови на n-й пищевой антиген, представлено на рисунке 1:

Полученный графический образ дискретного вариационного ранжированного ряда может быть интерпретирован как специфичный «иммунный ответ» конкретного организма на статистическую выборку тестируемых пищевых антигенов объемом N, полученную из генеральной совокупности Ng по определенным селективным критериям, главным из которых является статистически достоверный набор продуктов, наиболее часто употребляемых в рационе исследуемой популяции.
Поскольку для определения скрытой пищевой аллергии методом ИФА независимо определяется концентрация специфических IgG на большое количество отдельных пищевых антигенов, то корректное использование методов математической статистики требует априорной информации о виде функции плотности распределения вероятности регистрируемых «иммунных откликов» [13, 14]. Поскольку биохимическая роль разных классов иммуноглобулинов [15] различна, можно предположить, что иммунологический тест на специфические пищевые IgG, формально аналогичный подобному тесту на IgЕ, должен существенно отличаться от последнего как подходом к обработке данных, так и логикой выводов по результатам тестирования.
Статистический анализ результатов определения концентрации специфических IgG методом ИФА, представленных в виде «иммунных ответов» или графических образов дискретных вариационных ранжированных рядов и соответствующих распределений частот вариантов «иммунных откликов», проведенный по данным тестирования более 10 000 человек в Европе и США на тест-системах разных производителей, совпадающих по антигенам, позволил выявить следующие общие статистические закономерности.
Огибающие «иммунных ответов», представленных в виде графических образов дискретных вариационных ранжированных рядов, показаны на рисунке 2:

Они состоят из двух характерных участков: нелинейной части (1) и участка монотонных откликов (2). При этом нелинейная область (1) имеет характерный специфический и неповторимый вид для каждого ИФА на IgG. Подобная структура огибающих «иммунных ответов» наблюдается при любых «фоновых» концентрациях IgG, не зависит от набора пищевых антигенов и имеет общий характер для всех ИФА на IgG [16, 17]. Характерный графический образ i-го «иммунного ответа» и соответствующий спектр частот вариантов представлены на рисунках 3 и 4:

Область нелинейных «иммунных откликов» на рис. 3 адекватно отражает дискретную область спектра частот вариантов рисунке 4. Подобное соответствие имеет место для всех без исключения пар «иммунный ответ» – спектр частот вариантов «иммунных откликов», наблюдаемых на практике.
Вид «обобщенного» спектра частот вариантов «иммунных откликов» по представительной выборке характерных «иммунных ответов» показан на рисунке 5.

Сплошная часть подобного «обобщенного» спектра частот вариантов «иммунных откликов» достаточно хорошо описывается логарифмически-нормальной зависимостью при любом представительном наборе числа вариантов. Дискретная часть подобного спектра представляет собой также обобщенную совокупность единичных частот вариантов, соответствующих области нелинейных «иммунных откликов».
На основании проведенных статистических исследований нами предложен диагностический критерий норма–патология, где граница раздела «иммунного ответа», определяющая продукты-антагонисты, производится не по абсолютным значениям амплитуд «иммунных откликов», а по началу перехода квазилинейного участка огибающей «иммунного ответа» к аномальному участку с существенной нелинейностью огибающей. На спектрах частот вариантов «иммунных откликов» эта область совпадает с областью перехода от сплошной части спектра к дискретной. При подобном подходе абсолютные значения амплитуд откликов, как и наличие меняющегося «фонового уровня», не играют никакой роли в интерпретации результатов тестирования. Рассматриваются только вид огибающих ранжированного вариационного дискретного ряда и соответствующий спектр частот вариантов «иммунных откликов». Графические образы «иммунных ответов», как и характер соответствующих спектров частот вариантов «иммунных откликов», различны, неповторимы и строго индивидуальны для каждого пациента, что позволяет рассматривать их в качестве достоверного инструмента как идентификации продуктов-антагонистов, так и степени реактивности иммунной системы пациента.
Полученный критерий был использован для диагностики пищевой аллергии III типа у нескольких тысяч пациентов в США и ЕС. Он показал хорошие клинические результаты для устранения различных системных заболеваний, ассоциируемых клинически с пищевой непереносимостью [18]. При этом использование традиционного линейного критерия для диагностики пищевой аллергии не давало клинического эффекта [19].
Таким образом, предлагаемый подход к обработке и интерпретации данных распознавания образа фазового состояния биологического объекта на основе ранжированного ряда концентраций специфических иммуноглобулинов класса IgG может служить основой для более корректной диагностики у пациентов с различными симптомами пищевой аллергии, чем используемый до настоящего времени метод с жестко установленной границей нормы, не учитывающий индивидуальные особенности конкретного организма.

APPLICATION OF NONSPECIFIC BIOSENSORS METHODOLOGY FOR RIGHT CHOICE OF DIAGNOSTIC CRITERIA FOR FOOD ALLERGY AND INTOLERANCE ON THE BASIS SPECIFIC HUMAN IGG DETERMINATION

M.Yu. Rozenshteyn, E.S. Ihalainen, S.E. Kondakov, O.S. Prokopzeva, A.Z. Rozenshteyn (Division of Kinetics Chemistry)

Under consideration is the application of methodology of non-specific biomarkers to the interpretation of the titres of specific immunoglobulins of type IgG for the purpose of accurate determination of a threshold between normal and abnormal values. Proposed is a mathematical model of assessment of a phase status of a biological entity based on the ranking of a series of concentrations of specific immunoglobulins of type IgG.

Key words: immunochemistry, biosensors methodology, food biochemistry, food